微生物の取り扱いにおける基本操作 ３ 無菌操作

（３）無菌操作

　微生物学実験では培地・器具を滅菌することが必要である他に、植菌操作などにおいて空中に浮遊する雑菌の混入を避けて操作（無菌操作）する必要がある。通常の実験室内において解放状態で行う無菌操作から、無菌室内で最大の注意を払って行う操作まである。それらは実験条件により必要とされる無菌の程度に応じて使い分けられる。

A．解放状態での無菌操作

　通常の実験室でも胞子の飛散しやすいカビ類などを同時に取り扱っていない場所では、落下菌数もそれほど多くない。したがって、高い無菌度を要求されない培養（増殖速度が速くかつ短期間の培養が目的）では、解放状態で無菌操作を行うことが可能である。ガスバーナーの炎を強くし生ずる上昇気流の中で操作を行えば、落下菌の混入を避けることができる。

B．無菌箱

　内部を滅菌したガラス張りの無菌箱（カステン）を用いることにより、多くの微生物学実験で必要な無菌度を得ることができる。箱内の滅菌に備え付けの紫外線ランプがある場合は、30 分以上照射を行った後、紫外線ランプを消して操作を行う。紫外線ランプのない無菌箱では、逆性セッケン原液を 1/100 - 1/200 に希釈した液を内部に噴霧器で噴霧する。30 分くらい放置することにより霧とともに空中の雑菌が沈降するのを待ち、使用する。無菌箱内に持ち込む器具類は、逆性セッケン液につけて絞った布で可能な限り拭き取ってから入れるようにする。箱内には試験管や白金耳を寝かせておくための簡単なガラス棒架台を入れておくと便利である。無菌箱内でのカビ類の移植は、相互の混入を防ぐため、同時に行うのは 2 - 3 種程度にとどめるのが望ましい。

C．クリーンベンチ

　大型のガラス箱内に紫外線ランプ、無菌フィルター、エアカーテンなどを装備し、箱内の無菌空気を常に下から上へと循環させ、外部とはエアカーテンで遮断する装置がクリーンベンチである。このような装置では高度な無菌状態を実現できる。

（４）培養法（好気性および通性嫌気性微生物の培養）

A. 固体培養

ａ．斜面培養法（slant culture）

　径 18 mm の殺菌試験管に寒天培地を約 10 ml ずつ分注し、オートクレイブで殺菌した後、斜面培地をつくる。斜面をつくる際には、培地を綿栓に付着させぬこと、ねかし過ぎないこと（低部から 2 cm ほどのところから斜面をつくるとよい）などの注意が必要である。なお、斜面に限らずいずれの培地にもあてはまることではあるが、培地は殺菌後に恒温器へ入れて雑菌が生育してこないことを確認することが望ましい。

　

図 　接種のしかた

斜面培地ができたら無菌操作により目的菌を接種する。火炎殺菌した白金耳で種菌をとり、斜面上に下から上へ軽く一直線を画す（図 ）。この場合、白金線の

先端は、細菌、酵母では「針」か「耳」を用いるが、カビの場合は「鉤」が便利である（図 ）。斜面培地では凝縮水が底部にたまることがある。そのような状態のほうが菌の生育に良好な結果を示すが、酵母のように糖類を含む培地でガスを発生させる菌の場合は、凝縮水に菌を浸さないようにする注意が必要である。菌を接種した斜面培地は恒温器に入れて生育させる。

ｂ．穿刺培養法（stab culture）

　通性嫌気性菌の保存、一般細菌および酵母の生理・生態の観察のために用いられる。前項と同じく適当な寒天培地を綿栓した試験管に入れ、殺菌後直立させて放冷凝固させる。白金線の先端に種菌をとり、管口を斜め下に向けて培地の中央の管底近くまで穿刺する（管底まで穿刺してはいけない）。

　ガス発生菌では泡を生じたり、割れ目ができる。

B.　液体培養法

　生育状態、生理を観察する場合、培養液の化学的な分析を行う場合、菌体を多量に得ようとする場合、液中にとくに通気が必要な場合などに行うもので、次のような方法がある。

ａ．静置培養（standing culture）法

　試験管に 5 - 10 ml の培地を分注し、殺菌後白金耳で接種して恒温器で培養する。供試培地での繁殖の有無、菌蓋または皮膜、沈澱物形成の有無、ガス発生および簡単な生産物の検出反応などを観察するのに用いられる。したがって、用いる培地はできるだけ透明で沈澱物のないものを使用する。

ｂ．通気培養（aeration culture）法

　とくに酸化発酵の場合あるいは細菌、酵母などが液内に通気することによって多量に増殖する場合に用いる。普通は三角フラスコなどの中に除菌フィルターを通した空気をエアーコンプレッサーなどで送り込み簡単にその目的を果たすことができる。

ｃ．振盪培養（shaking culture）法

　これは通気培養法の一種であるが、前項とは異なり往復振盪機（reciprocal shaker, 120 - 160 rpm）または回転振盪機（rotary shaker, 150 - 300 rpm）上に載せ、連続的に培養液を振盪することにより通気し、かつ撹拌するものである。往復振盪機の場合、一般に、500 ml 容の肩付き振盪フラスコ（坂口フラスコ）に 50 - 100 ml の培養液を分注して用いる。回転振盪機の場合は三角フラスコを用いる（図 Ⅵ-4）。この他、試験管振盪培養機も用いられる。

　この場合注意すべき点は綿栓がかた過ぎないこと、雑菌混入の危険を避けるため綿栓を濡らさないようにすること、少し多量の種菌を接種することなどである。